Offentlig dataanalyse
Data om SARS-CoV-2-linjer og datoen prøven ble tatt fra sekvensene tilgjengelig fra Chile ble hentet fra Consorcio Genomas CoV2-stedet tilgjengelig på https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Vaksinasjonsdata ble innhentet fra offentlige data fra departementet for Vitenskap, teknologi, kunnskap og innovasjon tilgjengelig på https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Produkt 83).
Infektivitetsanalyse
Pseudotypede virus som bærer forskjellige SARS-CoV-2 spikeproteiner ble fremstilt som vi tidligere har beskrevet12. Kort fortalt ble HIV-1-baserte SARS-CoV-2-pseudotyper produsert i HEK293T-celler ved å transfisere pNL4.3-ΔEnv-Luc sammen med den tilsvarende pCDNA-SARS-CoV-2 Spike-kodende vektoren i et 1:1 molart forhold. Plasmider som koder for en kodonoptimalisert pigg som mangler de siste 19 aminosyrene i den C-terminale enden (SΔ19) kjent for å unngå retensjon ved det endoplasmatiske retikulum12 ble oppnådd ved gensyntese eller tilpasset stedsrettet mutagenese (GeneScript) og inneholdt følgende mutasjoner: avstamning A (referansesekvens), avstamning B (D614G), avstamning B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), avstamning P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027G, 37G, 75G, 76G, T246 252- 452, L490Q, F614S, D859G, T3,000N). Hvert pseudotypepreparat ble fjernet ved sentrifugering ved 1 rpm ved romtemperatur, kvantifisert ved bruk av HIV-24 Gag p50 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems), alikvotert i 80 % føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich) og lagret ved -1 °C til bruk. Ulike mengder pseudotype virus (som bestemt av nivåene av HIV-24 p2-proteinet) ble brukt til å infisere HEK-ACE48-celler, og 96 timer senere ble ildflue-luciferaseaktiviteten målt ved å bruke Luciferase Assay Reagent (Promega) i en Glomax XNUMX mikroplate luminometer (Promega).
Nøytraliseringsanalyse
Pseudotype virusnøytraliseringsanalyser ble utført hovedsakelig som vi tidligere beskrevet12. Kort fortalt ble seriefortynninger av plasmaprøvene (1:4 til 1:8748) fremstilt i DMEM med 10 % føtalt bovint serum og inkubert med 5 ng p24 av hvert pseudotype virus i løpet av 1 time ved 37 °C og deretter 1×104 av HEK-ACE2-celler ble tilsatt til hver brønn. HEK293T-celler (som ikke uttrykker ACE2) inkubert med det pseudotypede viruset (avstamning A) ble brukt som en negativ kontroll. Celler ble lysert 48 timer senere, og ildflueluciferaseaktivitet ble målt ved å bruke Luciferase Assay Reagent (Promega) i et Glomax 96 Microplate luminometer (Promega). Prosentandelen av nøytralisering for hver fortynning ble beregnet og ID50 for hver prøve ble beregnet ved å bruke GraphPad Prism versjon 9.0.1.
statistiske analyser
Statistiske analyser ble utført ved å bruke GraphPad Prism programvareversjon 9.1.2. Flere gruppesammenlikninger for nøytraliserende antistofftitere (NAbTs) mot et panel av SARS-CoV-2 pseudotype-virus samt sammenligninger av NAbs-responser etter kjønn og røykstatus ble utført ved bruk av en paret Wilcoxon signert-rangert test. Faktorendring ble beregnet som differansen av geometrisk middeltiter i ID50 sammenlignet med det for villtype pseudotype-viruset. Korrelasjonsanalyse mellom NAbT og alder eller BMI ble utført ved bruk av Spearmans test. Enveis ANOVA og Tukeys multiple sammenligningstest ble utført for statistisk analyse av smitteevne. En p-verdi ≤0.05 ble ansett som statistisk signifikant.
Etisk godkjenning
Studieprotokollen ble godkjent av Etikkkomiteen ved Det medisinske fakultet ved Universidad de Chile (prosjekt nr. 0361-2021 og nr. 096-2020) og Clínica Santa Maria (prosjekt nr. 132604-21). Alle givere signerte det informerte samtykket, og prøvene deres ble anonymisert.
Effekten av piggmutasjonene i Lambda-varianten på infeksjonsevne og nøytraliserende antistoffresponser
En analyse av 3695 sekvenser fra Chile deponert hos GISAID per 24. junith 2021 viser en klar dominans av SARS-CoV-2-variantene Gamma og Lambda i løpet av siste trimester, sammenlagt for 79 % av alle sekvenser.
Interessant nok har denne perioden vært preget av en massiv vaksinasjonskampanje der 65.6 % av målgruppen (18 år og eldre individer) har mottatt et komplett vaksinasjonsopplegg per 27. junith 2021
Gitt at 78.2 % av personene som ble inokulert med et komplett opplegg mottok den inaktiverte virusvaksinen CoronaVac fra Sinovac Biotech, forsøkte vi å undersøke virkningen av piggmutasjonene som finnes i Lambda-varianten på den nøytraliserende kapasiteten til antistoffer fremkalt av denne vaksinen.
For dette genererte vi HIV-1-baserte SARS-CoV-2 pseudotype-virus som bærer piggproteinet fra Wuhan-1-referanselinjen (villtype; avstamning A), D614G-mutasjonen (avstamning B) og alfa (avstamning B) .1.1.7), Gamma (linje P.1) og Lambda (linje C.37) varianter.
Under viruspreparering observerte vi konsekvent at celler infisert med det pseudotypede viruset som bærer Lambda-piggen produserte betydelig høyere bioluminescensverdier sammenlignet med D614G-mutanten eller alfa- og gamma-variantene, noe som indikerer økt infeksjonsevne drevet av Lambda-spikeproteinet
Figur 1.Infektivitet mediert av forskjellige piggproteiner.
(A) Skjematisk representasjon av SARS-CoV-2 piggproteinet og variantene brukt i denne studien. Slektslinjer er angitt i parentes. RBD, reseptorbindende domene, CM; cytoplasmatisk hale.
(B) Titrering av pseudotypene til hver avstamning ved bruk av ekvivalente mengder HIV-1 p24. Ildflueluciferaseaktiviteten ble målt som relative luminescensenheter (RLU) 48 timer etter infeksjon. Gjennomsnittet og SD ble beregnet fra et representativt trippeleksperiment.
Deretter brukte vi de pseudotypede virusene nevnt ovenfor til å utføre nøytraliseringsanalyser ved å bruke 79 plasmaprøver fra friske helsearbeidere fra Universidad de Chile og Clínica Santa María i Santiago, Chile.
Vi ekskluderte 4 prøver da vi ikke var i stand til å beregne en ID50-titer. Fra de analyserte prøvene tilsvarte 73 % kvinner, median alder 34 år (IQR 29 – 43) og en kroppsmaksindeks (BMI) på 25 (IQR 22.7 – 27). 20.5 % av deltakerne erklærte å være aktive røykere mens vaksinasjonsperioden varte. Prøver ble tatt i en median på 95 dager (IQR 76 – 96) etter den andre dosen av CoronaVac-vaksinen
Vi observerte at nøytralisering av det pseudotypede viruset som bærer villtype piggproteinet resulterte i en 50 % hemmende fortynning (ID50) mean titer of 191.46 (154.9 – 227.95, 95% CI,), while it was 153.92 (115.68 – 192.16, 95% CI), 124.73 (86.2 – 163.2, 95% CI), 104.57 (75.02 – 134.11, 95% CI ) og 78.75 (49.8 – 107.6, 95 % KI) for pseudotypede virus som bærer spikeproteinet fra henholdsvis D614G-mutanten eller alfa-, gamma- og lambda-variantene.
Vi observerte også at den geometriske middeltiteren til ID50 titere redusert med en faktor på 3.05 (2.57 – 3.61, 95 % KI) for det pseudotypede viruset som bærer Lambda-toppen, 2.33 (1.95 – 2.80, 95 % KI) for gamma-toppen, 2.03 (1.71 – 2.41 CI,) for Alpha-toppen og 95 (1.37 – 1.20, 1.55 % CI) for D95G-piggen sammenlignet med Wild-type-piggen.
Ingen korrelasjon mellom kjønn, alder, kroppsmasseindeks (BMI) eller røykstatus og nøytraliserende antistofftitere ble observert i vår studiekohort.
Figur 2.Nøytraliseringsanalyse ved bruk av plasmaprøver fra CoronaVac-vaksinerte
(A) Endringer i den gjensidige 50 % nøytraliseringstiteren (ID50) i plasmaprøver fra 75 mottakere av CoronaVac-vaksinen mot D614G (avstamning B), alfa (avstamning B.1.1.7),
Gamma (linje P.1) og Lambda (linje C.37) varianter sammenlignet med villtype virus. Resultatene er vist som forskjellen i nøytraliseringstitre for matchede prøver. P-verdier for sammenligning av ID50 beregnes med Wilcoxon signed-rank test.
(B) Boksplott indikerte median- og interkvartilområdet (IQR) av ID50 for hvert pseudotype virus. Faktorendringer vises som differansen av geometrisk middeltiter i ID50 sammenlignet med de for villtype pseudotype virus. Statistiske analyser ble utført ved bruk av Wilcoxon matched-pairs signed-rank test.
Sammen avslørte dataene våre at piggproteinet til den nylig anerkjente varianten av interesse Lambda, som sirkulerer høyt i Chile og Sør-Amerika, bærer mutasjoner som gir økt infeksjonsevne og evnen til å rømme fra nøytraliserende antistoffer fremkalt av CoronaVac.
