Dødstid: Ny teknologi som trengs for større nøyaktighet

For forskere som studerer nevrodegenerasjon, gjør denne mangelen på en presis "dødstidspunkt"-erklæring for nevroner det vanskelig å finne ut hvilke faktorer som fører til celledød og å screene medisiner som kan redde aldrende celler fra å dø.              

Nå har forskere ved Gladstone Institutes utviklet en ny teknologi som lar dem spore tusenvis av celler om gangen og bestemme det nøyaktige dødsøyeblikket for enhver celle i gruppen. Teamet viste, i en artikkel publisert i tidsskriftet Nature Communications, at tilnærmingen fungerer i gnager- og menneskeceller så vel som i levende sebrafisk, og kan brukes til å følge cellene over en periode på uker til måneder.

"Å få et nøyaktig dødstidspunkt er veldig viktig for å avdekke årsak og virkning ved nevrodegenerative sykdommer," sier Steve Finkbeiner, MD, PhD, direktør for Center for Systems and Therapeutics ved Gladstone og seniorforfatter av begge nye studiene. "Det lar oss finne ut hvilke faktorer som direkte forårsaker celledød, som er tilfeldige, og som kan være mestringsmekanismer som forsinker døden."

I en ledsagerartikkel publisert i tidsskriftet Science Advances kombinerte forskerne cellesensorteknologien med en maskinlæringstilnærming, og lærte en datamaskin å skille levende og døde celler 100 ganger raskere og mer nøyaktig enn et menneske.

"Det tok studenter måneder å analysere denne typen data for hånd, og det nye systemet vårt er nesten øyeblikkelig - det kjører faktisk raskere enn vi kan ta nye bilder på mikroskopet," sier Jeremy Linsley, PhD, en vitenskapelig programleder i Finkbeiner's lab og førsteforfatter av begge nye artikler.

Lære en gammel sensor nye triks

Når celler dør – uansett årsak eller mekanisme – blir de til slutt fragmentert og membranene deres degenererer. Men denne nedbrytningsprosessen tar tid, og gjør det vanskelig for forskere å skille mellom celler som for lengst har sluttet å fungere, de som er syke og døende, og de som er friske.

Forskere bruker vanligvis fluorescerende merker eller fargestoffer for å følge syke celler med et mikroskop over tid og prøve å diagnostisere hvor de er innenfor denne nedbrytningsprosessen. Mange indikatorfargestoffer, flekker og etiketter er utviklet for å skille de allerede døde cellene fra de som fortsatt er i live, men de virker ofte bare over korte perioder før de falmer og kan også være giftige for cellene når de påføres.

"Vi ønsket virkelig en indikator som varer i hele en celles levetid - ikke bare noen få timer - og som gir et klart signal først etter det spesifikke øyeblikket cellen dør," sier Linsley.

Linsley, Finkbeiner og deres kolleger valgte kalsiumsensorer, opprinnelig designet for å spore nivåer av kalsium inne i en celle. Når en celle dør og dens membraner blir utette, er en bivirkning at kalsium strømmer inn i cellens vannholdige cytosol, som normalt har relativt lave nivåer av kalsium.

Så, Linsley konstruerte kalsiumsensorene til å ligge i cytosolen, hvor de ville fluorescere bare når kalsiumnivået økte til et nivå som indikerer celledød. De nye sensorene, kjent som genetisk kodet dødsindikator (GEDI, uttales som Jedi i Star Wars), kan settes inn i en hvilken som helst type celle og signalisere at cellen er levende eller død over hele cellens levetid.

For å teste nytten av de redesignede sensorene, plasserte gruppen store grupper av nevroner - som hver inneholder GEDI - under mikroskopet. Etter å ha visualisert mer enn en million celler, i noen tilfeller utsatt for nevrodegenerasjon og i andre utsatt for giftige forbindelser, fant forskerne at GEDI-sensoren var langt mer nøyaktig enn andre celledødsindikatorer: det var ikke et eneste tilfelle der sensoren var aktivert og en celle forble i live. Dessuten, i tillegg til denne nøyaktigheten, så det ut til at GEDI også oppdaget celledød på et tidligere stadium enn tidligere metoder - nær "point of no return" for celledød.

"Dette lar deg skille levende og døde celler på en måte som aldri har vært mulig før," sier Linsley.

Overmenneskelig dødsdeteksjon

Linsley nevnte GEDI for sin bror - Drew Linsley, PhD, en assisterende professor ved Brown University som spesialiserer seg på å bruke kunstig intelligens på biologiske data i stor skala. Broren hans foreslo at forskerne skulle bruke sensoren, kombinert med en maskinlæringstilnærming, for å lære et datasystem å gjenkjenne levende og døde hjerneceller kun basert på cellens form.

Teamet koblet resultater fra den nye sensoren med standard fluorescensdata på de samme nevronene, og de lærte en datamodell, kalt BO-CNN, for å gjenkjenne de typiske fluorescensmønstrene knyttet til hvordan døende celler ser ut. Modellen, viste Linsley-brødrene, var 96 prosent nøyaktig og bedre enn hva menneskelige observatører kan gjøre, og var mer enn 100 ganger raskere enn tidligere metoder for å skille mellom levende og døde celler.

"For noen celletyper er det ekstremt vanskelig for en person å finne ut om en celle er levende eller død - men vår datamodell, ved å lære fra GEDI, var i stand til å differensiere dem basert på deler av bildene vi ikke tidligere hadde kjent var hjelpsomme med å skille levende og døde celler, sier Jeremy Linsley.

Både GEDI og BO-CNN vil nå tillate forskerne å utføre nye studier med høy gjennomstrømning for å finne ut når og hvor hjerneceller dør – et svært viktig endepunkt for noen av de viktigste sykdommene. De kan også screene medisiner for deres evne til å forsinke eller unngå celledød ved nevrodegenerative sykdommer. Eller, i tilfelle av kreft, kan de søke etter medisiner som fremskynder døden til syke celler.

"Disse teknologiene endrer spill i vår evne til å forstå hvor, når og hvorfor døden skjer i celler," sier Finkbeiner. "For første gang kan vi virkelig utnytte hastigheten og omfanget som tilbys av fremskritt innen robotassistert mikroskopi for mer nøyaktig å oppdage celledød, og gjøre det i god tid før dødsøyeblikket. Vi håper dette kan føre til mer spesifikk terapi for mange nevrodegenerative sykdommer som så langt har vært uhelbredelige."